Inhibició de la replicació del virus de l’hepatitis C per un mecanisme cel•lular diferent al de les drogues clàssiques.

Introducció

La nitazoxanida és un antimacrobià d’ampli espectre amb activitat contra diferents microorganismes. Si bé inicialment es va utilitzar per al tractament de les infeccions intestinals per protozoaris, les propietats antivirals de la nitazoxanida es van descobrir mentre se l’emprava per a la teràpia de la criptosporidiosis en els pacients amb sida. En l’actualitat, aquest fàrmac es troba en avaluació clínica per al tractament de l’hepatitis C crònica, amb resultats promissoris quan s’associa amb interferó pegilat, ja sigui sol o en combinació amb la ribavirina.

La nitazoxanida i el seu metabolit actiu, la tizoxanida, inhibeixen la replicació dels genotips 1a i 1 b del virus de l’hepatitis C. Ambdues drogues tenen acció sinèrgica amb el interferó-alfa i amb la 2-C-metil-citidina (2CMC), i fins i tot són eficaces contra els replicons del virus, resistents a la pròpia 2CMC i al telaprevir.

En aquest treball, els autors van presentar els resultats de l’avaluació in vitro de l’activitat de la nitazoxanida, la tizoxanida, el  interferó-alfa, la ribavirina i la 2CMC sobre la replicació del virus de l’hepatitis C en cultius de línies cel•lulars. A tal |finalitat, van realitzar la transferència de l’ARN complet de les cèl•lules amb replicons virals, sensibles o resistents a la tizoxanida.

Materials i mètodes

Es va transferir ARN trascript in vitro mitjançant l’ús d’un plàsmid en cultius de la línia cel•lular Huh7, que van ser covats en medis apropiats durant 3 setmanes. Transcorregut aquest període es va obtenir una colònia resistent a l’activitat de l’antibiòtic G418, que va ser aïllada, expandida i sotmesa a múltiples passatges per concentracions creixents del fàrmac esmentat. Aquesta colònia va ser denominada RP7.

A partir d’algunes de les cèl•lules del cultiu RP7, es va induir la resistència a nitazoxanida i a tizoxanida mitjançant l’exposició a dosis titulades d’ambdós fàrmacs als medis de cultiu. D’aquesta manera, es van obtenir 2 línies cel•lulars noves, resistents a una concentració d’11 µM de nitazoxanida i a 9 µM de tizoxanida, denominades NTZ-11 i TIZ-9, respectivament.

L’activitat antiviral de cada una de les drogues avaluades es va mesurar a través del càlcul de les concentracions eficaces (CE50 i CE90) per regressió linear. De la mateixa manera, es va estimar la CC50 (definida com la concentració del fàrmac que va produir el 50% de reducció en la captació de colorant vermell neutre dels cultius cel•lulars no tractats).

Resultats

El nivell inicial d’ARN viral va ser similar en les 3 línies cel•lulars considerades. Els cultius de cèl•lules amb replicons virals resistents a nitazoxanida i a tizoxanida van tenir una reducció de 2 a 4 vegades en la sensibilitat als efectes citotòxics d’aquestes drogues, però la disminució dels efectes antivirals va ser de 7 a 34 vegades major. La sensibilitat relativa de la replicació viral, tant per a la ribavirina com per a la 2CMC, va ser equivalent en les línies RP7, NTZ-11 i TIZ-9. De tota manera, la potència del interferó sobre la replicació del virus en les línies cel•lulars resistents va anar 3 a 8 vegades superior a l’obtinguda sobre les cèl•lules de la línia RP7.

Per provar la hipòtesi que la menor sensibilitat a la tizoxanida i la major sensibilitat al interferó eren el resultat de mutacions genètiques induïdes en els replicons de les cèl•lules de NTZ-11 i TIZ-9, els autors van transferir l’ARN d’aquestes línies a un cultiu de cèl•lules Huh7.5 no exposat a fàrmacs. No es van observar diferències significatives en la sensibilitat de les colònies a la tizoxanida, al interferó o a la 2CMC. D’aquesta manera, amb l’exposició a nivells de 100 IU/ml d’interferó o 10 µM de tizoxanida es va aconseguir la inhibició completa de la formació de colònies, de manera independent de la font d’ARN utilitzada. De la mateixa manera, no es van verificar diferències rellevants en el nombre relatiu de colònies produïda a partir de l’ARN, tant de cèl•lules resistents com de les línies cel•lulars originals.

Discussió

Després del passatge seriat d’elements de la línia cel•lular RP7 en medis de cultiu que contenien nitazoxanida o tizoxanida, la sensibilitat relativa de les línies cel•lulars resultants als efectes citotòxics i antivirals d’aquests fàrmacs va disminuir de manera substancial. En canvi, la susceptibilitat dels replicons resistents a la ribavirina i a la 2CMC no va presentar modificacions. De totes maneres, la replicació viral d’aquestes línies cel•lulars va resultar diverses vegades més sensible a les accions del interferó-alfa en comparació amb els cultius inicials.

Els investigadors afirmen que aquesta troballa és congruent amb els resultats d’alguns estudis anteriors, en els quals el tractament previ de les línies cel•lulars amb nitazoxanida va potenciar l’activitat d’una teràpia subsegüent amb l’associació entre aquest fàrmac i interferón. Així mateix, en altres publicacions es va esmentar que la taxa de resposta viral sembla augmentar quan s’administra nitazoxanida en forma prèvia o concomitant a l’ús d’interferó pegilat, amb ribavirina o sense ella. Els mecanismes d’interacció entre la nitazoxanida i el interferó sobre la inhibició del virus de l’hepatitis C es troben en fase d’investigació.

Si bé es van obtenir replicons amb resistència fenotípica a la nitazoxanida i a la tizoxanida mitjançant l’exposició seriada dels cultius cel•lulars a concentracions creixents d’aquestes drogues, els investigadors destaquen que no van aconseguir transferir aquesta resistència a través de la transinfecció per l’ARN de les cèl•lules afectades. En conseqüència, proposen que la resistència fenotípica s’associa amb canvis no identificats a les cèl•lules de l’hoste. L’aparent absència de resistència adquirida en la genoma del virus, exposat tant a la nitazoxanida com a la tizoxanida, contrasta amb la ràpida aparició de resistència durant el tractament de l’hepatitis C amb altres fàrmacs en fase experimental, com els inhibidors de la proteasa NS3 o de la polimerasa NS5B. En el cas d’aquestes drogues, la resistència pot atribuir-se a mutacions específiques en la genoma viral que es transmeten per transinfecció a les línies cel•lulars de cèl•lules Huh7 no infectades prèviament pel virus de l’hepatitis C.

Conclusions

Els autors assenyalen que la nitazoxanida i la tizoxanida inhibeixen la replicació del virus de l’hepatitis C per un mecanisme cel•lular diferent del de les drogues que s’empren clàssicament, però que és complementari al del interferó-alfa. Així mateix, asseguren que l’ús d’aquesta classe de fàrmacs per al tractament de l’hepatitis C crònica pot resultar promissori per permetre l’avenç de les investigacions clíniques.

19 NOV. 08 | Dres. Korba BE, Elazar M, Glenn JS i col·laboradors SIIC Antimicrobial Agents and Chemotherapy Ago 2008